 一、病原学检查 由于真菌广泛分布于自然界，甚至空气中也常有孢子飞扬，采集粪标本和检查操作中，应尽可能减少污染，标本要新鲜，有些真菌传染性很强如荚膜组织胞浆菌，应注意安全防护，以免造成实验室人员感染。 1、直接镜检标本：以10%氢氧化钾或生理盐水制片，高倍镜下发现大量菌丝和孢子有诊断意义，对于双相型真菌，仅查到孢子可能是正常带菌，真菌性肠炎的6种常见病原多数情况下直接镜检即可鉴定，但孢子，菌丝和其他背景物质有时相互混淆，不易辨认。 （1）菌丝和孢子：菌丝粗细一致，除毛霉菌外均有分隔，可见不同角度的分支，细胞质均匀，内含大小不等的颗粒，孢子多为圆形或卵圆形，多数大小一致，边缘整齐，可见细胞构造。 （2）细胞壁：在氢氧化钾溶液处理的标本中，细胞壁常变宽，连接成弧状，类似菌丝，但无菌丝的构造。 （3）石棉体：比菌丝更细，不分节，无菌丝颗粒。 （4）植物纤维：未消化的食物残渣，边缘不整，无分支。 （5）脂细胞：圆形，构造模糊，无细胞壁。 （6）磷脂小球：大小不一，形状不整，无细胞构造。 （7）氢氧化钾结晶：雪花样或珊瑚状，边缘呈锯齿形，折光性强。 （8）小水疱：圆形，透亮，无细胞构造。 2、染色镜检常用的染色方法： （1）革兰染色：适用于念珠菌，孢子，菌丝染成蓝色，但着色不均。 （2）过碘酸锡夫染色（PA5）：真菌孢子，菌丝均染成红色。 （3）丫啶橙染色：荧光显微镜下真菌孢子呈亮绿色。 （4）吉姆萨染色和瑞特染色：适用于荚膜组织胞浆菌，染色前用甲醇固定，油镜下菌体染成红色，较小一端有出芽，菌体周围有一圈荚膜样结构，为此菌的细胞壁，通常菌体位于巨噬细胞或单核细胞内，少数位于细胞外。 （5）乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌培养涂片，菌体染成蓝色。 3、真菌培养：粪标本直接镜检通常不容易确定菌种，需参考粪培养结果，观察菌落形态，再挑取菌落染色后镜检，常用沙保培养基和血琼脂培养基，对于双相型真菌还需在不同温度下（25℃或37℃）分别培养，以便观察其形态改变。 （1）大培养：是鉴别真菌的主要方法之一，可观察菌落的生长情况，根据菌落的生长速度，形态，色泽等，初步判别菌种。 A、试管斜面：用白金环刺破琼脂平面，分3点将标本接种于试管斜面培养基上，此法不易污染，但菌落较校 B、培养皿：分3点将标本接种于平皿培养基中央，倒置后放恒温箱中培养，每3天观察1次菌落生长情况。 （2）小培养：将大培养中生长较好的菌落接种在玻片培养基上，培养1～3天后，在显微镜下观察菌体的特征。 A、点片法：先将少许培养基成形于载玻片中央，再将菌种接种于培养基边缘，覆以盖玻片，置于有U形管的玻璃平皿中，培养后于不同时间取出镜下观察或染色镜检。、 B、压片法：将菌种接种在试管斜面或平皿培养基上，覆一盖玻片，以便菌体向盖玻片上生长，然后于适当时间取出置于载玻片上镜检。 二、组织病理学检查 有些真菌属于人肠道内正常菌群，如白念珠菌，且真菌污染问题广泛存在，所以粪标本病原学检查的诊断价值有限，有时需结合肠镜活检结果综合判断。 1、曲菌感染的病理变化：具有诊断意义，包括： （1）炎症：急性渗出性炎症。 （2）溃疡形成：由于曲菌侵犯血管，引起血管破坏，出现血栓和组织坏死；溃疡大小不一，形态各异，可深达肌层，底面粗糙不平，有脓性渗出。 （3）肉芽肿：由上皮细胞和巨噬细胞组成，伴有中性粒细胞，淋巴细胞或浆细胞浸润。 （4）化脓性改变：黏膜下小脓肿形成，大量中性粒细胞浸润，其中可见菌丝。 2、病理：切片中发现真菌孢子和菌丝，是侵袭性肠炎的直接证据，有肯定的诊断意义，染色方法包括： （1）过碘酸锡夫染色：真菌呈红色。 （2）乌洛托品银染色：真菌呈黑色。 （3）丫啶橙荧光染色：真菌呈黄色或红色荧光。 三、免疫学检查 1、真菌菌素皮肤试验：用念珠菌，曲菌，组织胞浆菌，副球孢子菌等真菌的菌素或菌苗，按不同的稀释比例做皮肤过敏试验，48h后出现直径大于5mm硬结或红斑为阳性，对于诊断临床症状不典型的患者，有参考价值。 2、血清抗原检测：病原真菌被人体吞噬细胞等处理降解后，细胞壁和细胞浆抗原游离于血循环中，未被清除者可经酶免疫法（EIA），间接血凝试验，免疫印迹法等检测，加热休克蛋白属于真菌胞浆抗原，对肿瘤并发侵袭型念珠菌病，于发病后24h内检测有50%阳性，特异性高达96%，又如用ElA法检测曲菌肠炎患者血清中的细胞壁抗原和能与刀豆素A结合的相关抗原，有早期诊断价值，定量检测抗原水平达100μg/ml时，可对真菌培养阴性者做出确诊。 3、血清抗体检测：补体结合试验对诊断组织胞浆菌肠炎有一定价值，可参考皮肤试验结果综合判断以排除假阳性，间接荧光素标记抗体定量试验可用于诊断念珠菌肠炎，此外，尚有对流免疫电泳，乳胶凝集试验，ELA等常用方法，以后者最为敏感，但对于艾滋病等伴有免疫功能抑制的患者，抗体检测容易出现假阴性。 4、猬集反应：念珠菌病患者血清内有一种猬集因子和抑制猬集现象的干扰物，前者可抑制由念珠菌在试管中的活力，血清猬集反应在正常人普遍存在，但感染念珠菌后，由于干扰物增多，猬集现象被抑制。 四、动物接种试验 对于粪标本真菌培养的菌落，其致病性如何，可进一步通过动物接种加以鉴定。 1、接种方法：刮取培养基上的菌落，研碎，加生理盐水稍加震荡，滤去菌丝，制成孢子混悬液，浓度为108/ml左右，注入动物体内，根据动物的大小及接种途径，剂量0.2～1.0ml不等，可反复多次接种以加强对动物的致病性。 2、动物的选择与接种途径：因菌种不同，对动物的感染性也不同，应选择适当的动物和不同的接种途径： （1）白念珠菌：选用兔静脉注射或小鼠腹腔注射。 （2）曲菌：选用兔，小鸡静脉或腹腔注射。 （3）毛霉菌：选用兔静脉注射。 （4）组织胞浆菌：菌液加5%胃黏液素，选用大鼠或小鼠腹腔注射。 （5）副球孢子菌：选用豚鼠睾丸内注射。 （6）地丝菌：对动物不致玻 3、动物解剖：解剖前将动物放入5%苯酚溶液中消毒，然后在无菌条件下检查相应组织，器官的病理改变，并取病灶材料作直接涂片和真菌培养，解剖后的动物尸体应火化，不可土埋，以免致病真菌扩散。 |
